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蛋白印迹，也称Western，Western blot、Western blotting、Western印迹，简称WB，是用免疫学方法检测蛋白，研究。蛋白质的表达调控的重要方法之一。在蛋白质进行SDS-PAGE电泳后，利用百奥莱博Western Blotting检测试剂盒可以完成转膜，膜的封闭，一抗孵育，二抗孵育和ECL化学发光检测的工作。

1. 转膜缓冲液配制：100mL转移缓冲液(10×)＋200mL无水甲醇＋700mL去离子水。
   
2. 洗涤液的配制：30mL洗涤液(10×)＋270mL去离子水＋150μL Tween 20。
   
3. 封闭液的配制：20mL洗涤液＋1.0g脱脂奶粉或20mL洗涤液＋0.6g BSA。

1. 转膜
   
   1. PVDF膜及滤纸的预处理：转膜前，裁剪与胶大小一致的PVDF膜泡入甲醇中，时间约为1min，小心取出膜放入蒸馏水中浸泡2min，然后把膜放置盛有转膜缓冲液的小槽中平衡15min，同时把已裁剪好的滤纸(与胶大小一致)和海绵也放入盛有转膜缓冲液的小槽中平衡15min。
      
   2. 转膜操作：
      
      1. 干式电转印
         将转印槽阴极平放工作台上，并在上面加三张经转膜缓冲液平衡好的1mm厚的滤纸，将经转膜缓冲液平衡好的PVDF膜放在滤纸上，再将凝胶平放在PVDF膜上，最后在凝胶上加盖三层经转膜缓冲液平衡好1mm厚的滤纸，接通电源，15V进行恒压，转膜的时间根据蛋白分子量的大小而调整，分子量为40～100KD的蛋白转膜30～45min。
         
      2. 湿式电转印
         打开电转夹，每侧垫上一块专用的转膜缓冲液平衡好的海面垫，再各放三块经转膜缓冲液平衡好的滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与PVDF膜、凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将经转膜缓冲液平衡好PVDF膜平放在凝胶上，按照(-)夹板-海棉-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-夹板(+)装好，除尽气泡，夹好电转印夹。电泳槽(槽的一边放一块冰来降温)加满预冷的转膜缓冲液，插入电转印夹，连接好电极，接通电流，转印夹的PVDF膜应对电泳槽的正极，100v恒压进行转膜，转膜的时间根据蛋白分子量的大小而调整，分子量为40～100KD的蛋白转膜60min。
         注：将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。)在垫子上垫三层滤纸(可三张纸先叠在一起在垫于垫子上)，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
         要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬(可边撬边用流水缓缓冲洗)。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。(撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲)除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作)，要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触(接触后会发生短路)。转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。
2. 膜的封闭
   转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的洗涤液中，漂洗1～2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕起，以后所有的步骤均要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。用巴斯特吸管吸尽洗涤液，加入封闭液，在摇床上缓慢摇动)，室温封闭60分钟。如背景较高，可以在4℃封闭过夜。在整个Western过程中可使用侧摆摇床，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖膜。
   
3. 一抗孵育
   参考一抗的说明书，按比例用封闭液稀释一抗。可用10×10cm杂交袋进行一抗孵育，所需一抗孵育约为1.0mL，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。取出膜，加入洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，漂洗3～5次，每次0分钟。如果结果背景较高可以适当延长漂洗时间并增加漂洗次数。
   
4. 二抗孵育
   根据一抗的类型，选择合适的二抗并参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。可用10×10cm杂交袋进行二抗孵育，所需二抗孵育约为1.0mL，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。加入洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，漂洗3～5次，每次10分钟。如果显色结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
   
5. ECL化学发光检测
   
   1. ECL工作液的配制
      取适量的Stock A和Stock B等体积配成工作液，混合后即为ECL工作液(ECL工作液应现配现用)。将膜片平铺，滴加ECL工作液使其将膜片完全覆盖(每平方厘米膜片至少使用0.1mLECL工作液)。室温孵育2～3分钟。
      
   2. 蛋白信号显现
      
      1. 用平头镊钳住膜片，垂直置于吸水纸以吸去过量ECL工作液。
         
      2. 置膜片于二层保鲜膜之间，小心赶尽气泡。
         
      3. 将膜片吸附蛋白面朝上，置于X光片盒中。
         
      4. 于暗室中压上X光片。
         
      5. 曝光30秒，显影之。
         
      6. 根据实际荧光强度选择合适曝光时间。曝光完毕后，进行显影和定影，冲洗胶片。